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    1. IPA案例十五——QIAGEN為循環轉錄組學提供進階RNA-Seq挖掘整體解決方案

      2018-06-06 11:22:07 來源:源資科技市場部

      新聞摘要:本文針對攝取胰腺癌外泌體后的Kupffer細胞的轉錄組進行分析,揭示了通過外泌體的癌癥轉移過程中涉及的途徑和生物學過程。主要采用了CLCbio的Bx進行了原始的測序數據的整理并使用IPA進行了深度數據挖掘。


      簡介:胰腺癌是預后差、最致命的惡性腫瘤之一。因此,了解腫瘤發生、發展和轉移的機制是一直是癌癥研究的重點。近來,液體活檢是一種全新的檢測手段,采用的是非侵入性的診斷方法來檢測癌癥的早期,為獲得更成功的治療提供基礎。其中一種液體活組織檢查技術是從腫瘤微環境來源的外泌體中檢測標志RNA,這些外泌體有可能參與了產生轉移的病灶。使用QIAGEN生物信息學解決方案與公開的數據集,深度挖掘了Kupffer細胞的攝取胰腺腫瘤來源的外泌體后轉錄組數據。以研究受到胰腺癌外泌體影響的Kupffer細胞誘導肝轉移灶的形成過程中涉及的途徑和生物學過程。


      實驗方法:
            1、如圖一所示,本文采用Kupffer細胞(KC細胞)加入從胰腺癌細胞系轉移到肝臟的外泌體(BxPC-3),設計對照,進行RNA-Seq數據采集。

       

      圖一:測序樣本準備流程圖。


            2、原文采用的是公共平臺和R進行處理,本文采用同樣的數據,用QIAGEN的Bx+IPA進行數據的深度挖掘。
            3、Bx進行RNA-Seq原始數據FASTQ處理。進行序列處理比對,最終得到基因或者轉錄本的表達值。并且獲得差異表達譜數據
            4、IPA處理差異表達譜數據進行深度數據挖掘。


      分析結果:
           
      1、Bx進行RNA-Seq原始數據FASTQ處理結果??梢栽贐x中直接搜索SRP058375,進行數據的下載和直接整理導入。

       

      圖二:可以采用Bx-Download-Search for reads in SRA工具,直接搜索SRA樣本號。并且全選所有數據,點擊紅框內按鈕,進行數據的直接下載和整理。

        2、采用Toolbox-RNA-Seq Analysis工具,可以直接獲得基因表達值(GE:Gene Expression)及轉錄本表達值(TE:Transcription Expression)

       

      圖三:存于Bx中處理好的樣本表達值

        所有表達值結果存在Bx的數據文件夾中,可以進行下游的差異表達分析。

       

      圖四:Bx可以針對每組數據的表達值進行基本的統計特征分析。能夠進行Venn Diagram,PCA plot, Heatmap,Volcano Plot的分析和繪制。

        按照Metadata分別計算單純BxPC-3組(僅添加外泌體組)和BxPC-3+ITGB5 inhibitor組與對照PBS組的差異值,并使用IPA插件,將結果直接上傳到IPA中進行查看。

       

      圖五:BxPC-3組對比PBS組計算的差異表達基因示例結果。這個結果可以直接在Bx中使用插件上傳到IPA中。

        Bx計算得出BxPC-3 exosomes VS PBS treated control,  BxPC-3 exosomes VS BxPC-3+ITGB5 inhibitor與BxPC-3+ITGB5 inhibitor VS PBS treated control三組的差異值,并且直接上傳到IPA中進行核心分析。

        3、IPA數據分析結果

        針對Bx給出的差異表達的數據集分別作了核心分析。統一采用Fold change FC為1.5,p值小于0.05,RPKM>5作為閾值,對三組數據進行了核心分析,并且將三組核心分析結果進行對比分析。
            通過IPA的分析,我們能夠進行以下問題的探索:
            哪些信號通路參與轉移前微環境的改變?
            靶細胞中哪些轉錄調控路徑是激活還是抑制的?
            Kupffer細胞攝取PDAC外泌體后發生了哪些生物學過程?
            有哪些基因發生了剪輯突變?
            從這個研究中我們能得到抑制PDAC轉移的什么啟示?

        IPA通過針對數據的核心分析和對比分析,逐一解決上述問題。

       

      圖六:核心分析總覽??傆[包括對經典通路,上游調節分子,疾病和生物學功能等內容的概括,能夠第一時間了解差異表達基因的聚類及分析結果。

      圖七:經典通路聚類結果。橙色代表被預測激活的通路,藍色代表被預測抑制通路。由圖上可以看出,在Kupffer細胞攝入BxPC-3外泌體后,基因表達和免疫反應相關的通路被激活了。排名第一的是IL-6信號通路,由此可見,IL-6信號通路會參與前轉移微環境的改變。

       

      圖八:IL-6信號通路的簡介,能夠在IPA中直接查看信號通路的介紹,參與基因,作用藥物,參與疾病和功能等信息。

       

      圖九:IL-6信號通路示意圖。BxPC-3 vs BxPC-3 Beta5KD的差異基因顯示IL6信號通路同樣被預測為激活狀態。對該信號通路進行深度探索,尋找這個信號通路參與的生物學過程,發現,這個信號通路主要參與白細胞分化過程。

        由通路聚類的結果可以看到在攝入BxPC-3外泌體后,IL-6通路成激活狀態,并且免疫反應相關的信號通路多為激活狀態,結合以上結論查看上游調控因子的分析結果來看。如果僅看細胞因子和生長因子為上游調控因子的結果,發現免疫反應相關的上游調控因子都發揮了激活下游分子的作用。

       

      圖十:與免疫反應相關的細胞因子和生長因子均表現出激活的作用。

       

      圖十一:根據圖十的結果,將IL-6及其下游因子共同進行網絡挖掘,發現這個網絡的分子參與了腫瘤細胞系的黏附和侵襲活動,并且參與了肝癌的發生。

       

       

      圖十二:進行上游調控因子的對比分析發現,TRIM24及其下游分子在攝入BxPC-3后被激活,能夠抑制細胞的免疫反應,而當其被抑制時則能激活細胞的免疫反應。而MEOX2攝入了BxPC-3被抑制,能夠激活Angiogenesis,metastasis和recruitment of myeloid cells幾個疾病和生物學過程。

       

      圖十三:進行三組數據份疾病和生物學功能對比分析發現,在攝入BxPC-3后,與腫瘤轉移與侵襲的功能被激活了。


       

      圖十四:采用IPA的Isoprofiler分析可以直接對比多條Isoform在不同的數據樣本中的表達值發現,有一條ITGB1-007轉錄本可能會在肝轉移的過程中起重要作用。

       

      圖十五:利用IsoProfiler分析得到與肝癌相關并且對BxPc-3攝入有反應的基因PKM。及其Isoform PKM-004可能會起到關鍵作用。

       

       

      圖十六:IPA的Causal Network分析能夠給出主調節因子,為分析給出可能的作用靶點。如圖示例,IL6R是一個主調節因子,攝入BxPC-3外泌體后,IL6R被激活并且激活轉移功能,如果使用toalizumab對IL6R進行抑制,能夠有效的抑制轉移。


      總結
            以上結果僅是IPA分析結果部分示例,從IPA中能夠得到的啟示性結果還有很多,能夠根據研究方向進行結果的解讀。就本案例為例,本文分析了Kupffer細胞攝入胰腺癌外泌體后的RNA表達數據,能夠得到下面的結果。
            哪些信號通路參與轉移前微環境的改變?(IL6信號通路)通過Canonical Pathways和Pathway Activity Analysis功能實現。
            靶細胞中哪些轉錄調控路徑是激活還是抑制的?(IL6,TRIM24,MEOX2)通過Upstream Analysis和Comparison Analysis功能實現。
            Kupffer細胞攝取PDAC外泌體后發生了哪些生物學過程?(纖維化,血管生成,免疫反應)通過Disease & Functions,Comparison Analysis和Downstream Effects Analysis功能實現。
            有哪些基因發生了剪輯突變?(ITGB1,PKM2)通過Isoform View和IsoProfiler功能實現。
            從這個研究中我們能得到抑制PDAC轉移的什么啟示?(IL6R,IL11RA)通過Causal Network Analysis功能實現。


      參考資料:
      源于QIAGEN官網Webinar:
      Understanding  the  circulating  transcriptome  with  Advanced  RNA-Seq Explorer Solution
      http://tv.qiagenbioinformatics.com/video/15765809/understanding-the-circulating-transcriptome-with

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